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利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌
作者刘娟娟，张妍，赫卫清
引用刘娟娟,张妍,赫卫清.利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌.生物工程学报,,37(6):-.
摘要：三可利霉素(Carrimycin，CAM)是将异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltransferasegene，ist)导入到螺旋链霉菌中产生的以异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin，ISP)为主组分的抗生素。原工程菌中的ist基因与螺旋霉素(Spiramycin，SP)生物合成基因簇相距较远，且具有两种抗性基因，难以对其进行基因改造，因此需要构建新型CAM工程菌株。文中通过CRISPR-Cas9基因编辑系统靶向切割2个位点，将ist和其正调控基因acyB2通过同源重组插入到SP生物合成基因簇附近且不参与SP合成的orf54基因下游，获得2种无外源抗性基因插入的CAM产生菌54IA-1和54IA-2，经发酵产物检测发现54IA-2菌株中的ISP产量明显高于54IA-1菌株。通过实时定量PCR(Quantitativereal-timePCR，qPCR)检测证实54IA-2菌株中ist和acyB2基因以及部分SP生物合成基因的表达量均高于54IA-1菌株。为进一步获得高产菌株，以54IA-2为出发菌株，利用核糖体工程的方法筛选利福平(Rifampicin，RFP)抗性菌株，在RFP浓度为40μg/mL的抗性菌株中，ISP的产量明显提高，最高可达.9μg/mL，比原始菌株提高约6倍。对其中7株菌的rpoB基因进行测序分析，每株菌的第位丝氨酸都突变为丙氨酸，在其他错义突变中产量最高的菌株RFP40-6-8在第位的谷氨酰胺突变为亮氨酸。综上所述，本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了无任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2，并通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8，为CAM工程菌株的进一步优化改造奠定了基础。
图片摘要
图1在SP生物合成基因簇下游插入ist-acyB2基因变株的构建(A)和验证(B)
图2菌株54IA-1和54IA-2发酵产物的HPLC检测
图3菌株54IA-1和54IA-2中ist和acyB2基因表达情况
■通讯作者
赫卫清：博士，中国医学科学院医药生物技术研究所抗生素生物工程重点实验室硕士研究生导师、副研究员。主要研究方向：利用合成生物学方法改造微生物药物产生菌来获得新的药用化合物或提高目标化合物的产量；微生物来源的糖基转移酶和糖基修饰酶的功能鉴定与改造；可利霉素及其工程菌的升级改造。承担国家自然科学基金面上项目、国家科技重大专项子课题和中国医学科学院医学与健康科技创新工程等项目，入选北京市科技新星计划。在JBacteriol、ApplMicrobiolBiotechnol和Microbiology-sgm等国内外期刊发表论文30余篇，获得授权专利8项，转让专利1项。